桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

作者：张淑红，吴清平，徐晓可，张菊梅，潘宝怡、彭飞艇
（广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,广东省微生物研究所，广东广州 510070）
摘要：分别采用传统国标GB/T 8538-2008 方法、基于OprL 基因的PCR 方法和环介导等温扩增(LAMP)方法检测桶装水中的铜绿假单胞菌，比较三种方法的检测效果。结果显示，采集的46 份市场水样中，用传统GB8538-2008 方法检出了3 份阳性样品，检出率为6.5%，检测时间至少2 天；而PCR 和LAMP 方法都检出4 份阳性样品，检出率为8.7%，并且可在24 h 内报告结果。PCR 和LAMP 方法与传统方法相比具有快速灵敏等优点，可用于大批量水样的快速检测和结果初筛。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病[1~3]。近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，国内外有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注
[4~10]。目前桶装饮用水铜绿假单胞菌检测技术方面，除传统的生化培养外，PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP）等分子方法逐步建立起来，应用于水样快速检测中。本文通过对市场销售的桶装水进行抽样检测，比较了传统培养法与PCR 和LAMP 方法的特点，为桶装饮用水的快速检测提供参考。
(全文 略)
本文抽查了广州市场上46 份各品牌桶装成品水，平行采用传统国标、PCR 方法和LAMP 方法对铜绿假单胞菌进行检测。结果发现，传统国标方法GB8538-2008 检出3 份阳性样品（8#、19#和22#），而PCR 和LAMP 方法结果一致，都可以检出4 份阳性样品（2#、8#、19#
和22#）。三种检测方法对8#、19#和22#样品的检测结果吻合，2#样品采用传统的膜过滤和平板培养方法未检出，但是经过PCR 产物测序证明样品中存在铜绿假单胞菌。造成这种差异结果的原因主要有两方面，一方面，分析可能是铜绿假单胞菌处于逆境下的不可培养态。另一方面，在桶装水中大量死菌存在时PCR可以检测出（PCR 灵敏度约为103 cfu/mL），而传统方法分离不到，PCR 检测结果假阳性。事实上，按照国家标准要求，我国饮用水处理工厂的水源水和水处理工艺相对严格，铜绿假单胞菌不可能达到很高的数量，成品水中存在大量死菌的情况比较少，因此，PCR 检测结果是假阳性的可能性较小，基本是由于活菌数量增长检测出的结果。很多情况下，铜绿假单胞菌经过水源水消毒，管道消毒和臭氧消毒后，其活力会大大降低，处于非可培养状态，导致传统方法培养不出和检测结果的假阴性，另外，在受到水中其他杂菌的抑制时也可能导致检测结果的假阴性[16~17]。鉴于此，本文在利用PCR 和LAMP 方法时进行了一定时间增菌（前期试验发现18 h 是两种检测方法最低的增菌时间），以尽量避免或减少检测结果假阴性。综合比较三种检测方法可以看出，传统方法的检测周期较长，至少2 天报告结果，检测灵敏度低，而PCR 和LAMP 方法都可以在24 h 内完成样品检测，具有简便、快速、灵敏等特点。PCR 方法整个过程约需要22 h（包括过滤1 min、增菌18 h、过滤1 min、DNA 提取15 min、PCR 扩增3 h、电泳0.5 h）；LAMP方法整个检测时间约为19 h（包括过滤1 min、增菌18 h、DNA 提取15 min、LAMP 扩增45 min）。与其他方法相比，LAMP 方法操作更简单，不需昂贵仪器，仅水浴锅就可以完成，且结果可用肉眼直接观察，已被成功应用于各种食源性致病菌的快速检测[18~19]。同样，在水样检测方面，为提高检测效率，可以将PCR和LAMP 应用于出厂水样铜绿假单胞菌的快速初筛。

 国标法铜绿假单胞菌检测仪器试剂：http://www.xmmc17.com/anquan/194.html