常见食源性微生物/细菌保藏方法

八、常见食源细菌的保存方法
1．蜡样芽孢杆菌
（1）短期保存
① 接种蜡样芽孢杆菌于营养琼脂斜面并于30℃～35℃培养24 h±2h。
② 在室温条件下(21℃~23℃)继续保持1d~2d以便于芽孢完全生成。
③ 在4℃条件下冷藏肉汤培养物。
（2）长期保存
① 将蜡样芽孢杆菌菌种接种于营养琼脂斜面，在30℃~35℃培养24 h±2h。
② 在室温条件下(21℃~23℃)继续保持l d~2d，以便于芽孢完全生成。
③  为了延缓细菌的生长，可以用蒸馏水与20％的甘油氯化钠溶液按l：1混合以后加到琼脂斜面上。
制备甘油氯化钠溶液：溶解4.2g的氯化钠，并加入蒸馏水，使体积达到800mL。在溶液中加入12.4g的无水磷酸氢二钾，4.0g无水磷酸二氢钾和200mL甘油。调整pH值至7.2，121℃，灭菌5min。
④ 将3mL 1：1的混合液迅速放入干冰中或超低温冷冻箱内进行冷冻，温度设定在-55℃到-90℃。
⑤ 每两年，按上法进行培养。
2．空肠弯曲杆菌
    所有的培养过程必须使用微需氧的空气环境：氮气占85％，二氧化碳占l0％，氧气占5％。
（1）短期保存
① 接种装有10mL酸水解酪素－酵母浸膏－氯化钠肉汤。
配制方法： 20g酸水解酪素（casamino acid）、6g酵母浸膏、2.5g氯化钠和 8.7lg无水磷酸氢二钾，补足蒸馏水至1L。121℃，15min灭菌。调整pH值，使其在灭菌后为8.5±0.2。
② 将接种过的培养基在41℃~44℃培养48 h±2h。
③ 在巧克力琼脂或血琼脂斜面上进行划线，41℃~44℃培养48h±2h。
④ 每周进行传代。
（2）长期保存
① 接种装有10mL酸水解酪素－酵母浸膏－氯化钠肉汤，于4l℃~44℃培养48h±2h。
② 在培养物内加入甘油，使最终浓度达到10％~20％。
③ 分装2mL~3mL，于-70℃或更低温度进行冷冻。
④ 每6个月传代一次。
3．肉毒梭菌
（1）短期保存
① 接种脱气后的装有疱肉培养基或含胰蛋白酶的胰酪胨－蛋白胨－葡萄糖－酵母浸膏肉汤（Trypticase-peptone-glucose-yeast extract broth,TPGYT），根据不同菌株选择26℃或35℃培养，26℃适于蛋白水解的A、B、F和G群，而35℃适于非蛋白水解的B、E和F群。
制备疱肉培养基：在12.5g的市售培养基内加入100mL冷却的蒸馏水。混合后保持15min，以便使里面所有颗粒都能湿透。另一种办法是分装1.25g市售培养基到20mm×150mm的试管内，加入10mL凉的蒸馏水，混合均匀，使所有颗粒都浸透。121℃，灭菌20min。最终的pH值为7.2±0.2。
TPGYT培养基无法买到，须用各种不同的原料自己配制。配制过程是在1L蒸馏水内溶解以下原料：50g胰酪胨、5g蛋白胨、20g酵母浸膏、4g葡萄糖和lg硫乙醇酸钠。分装15mL到20mm×150mm的试管内，121℃，灭菌10min。最终的pH值为7.0±0.2。冷藏灭菌后的培养基，在使用之前加入胰蛋白酶（trypsin）。
制做胰蛋白酶溶液：将1.5g的胰蛋白酶(1：250，Difco)加入100mL蒸馏水中。搅拌水中的胰蛋白酶使其悬起，让颗粒沉淀，用0.45μm的滤膜过滤上清液。使用之前蒸煮上述基础液10min，排出溶解氧。在每15mL基础液里加入1mL胰蛋白酶溶液。
② 根据培养细菌所要求的温度，培养5天或更长时间。
③ 在4℃可保存6个月。
（2）长期保存
① 按上述方法培养细菌。
② 用无菌的离心管盛TPGYT培养物离心，沉淀细菌芽孢。
③ 用10mL~20mL无菌蒸馏水冲洗细菌芽孢两次。
④ 用无菌蒸馏水重悬洗过的芽孢，将其储存于4℃。
⑤ 细菌芽孢悬液能稳定保存10年～20年。
4．产气荚膜梭菌
（1）短期保存
① 试管内装入10mL新脱气过的液体硫乙醇酸盐肉汤，接种入产气荚膜梭菌，在35℃~37℃厌氧条件下培养18h～20h。    
② 再将细菌接入脱气后的疱肉培养基，在35℃~37℃有氧条件下培养24h±2h。
③ 在室温环境(21℃~23℃)再培养1d~2d，使芽孢充分形成。
④ 在4℃条件下冷藏肉汤培养物。
⑤ 每30天进行传代。
（2）长期保存
① 接种产气荚膜梭菌到胰酪胨-蛋白胨-葡萄糖-酵母浸膏肉汤培养基。
配制方法：将50.0g胰酪胨、5.0g蛋白胨、20g酵母浸膏、4g葡萄糖、5g磷酸氢二钠和lg硫乙醇酸钠溶解到1L蒸馏水中。调整pH值为7.3±0.2，分装15mL到20mm×150mm的试管内，121℃，灭菌8min。使用之前将灭菌后的培养基冷藏保存。
② 将接种过的培养基于35℃~37℃培养18h。
③ 按1:1的量将肉汤培养物加入到脱脂奶中，取lmL～2mL进行冻干。或者按1:1的量将肉汤培养物加入到10％甘油氯化钠溶液中。甘油氯化钠溶液的制备：溶解4.2g氯化钠到900mL蒸馏水中。然后加入12.2g无水磷酸氢二钾、4g无水磷酸二氢钾和100mL甘油。调整pH值到7.2±0.2，然后在121℃，灭菌15min。
④ 取1mL～3mL1:1的培养物混合物，放入固体干冰中和超低温冰箱中保存，温度为-55℃～-90℃。
⑤ 每两年传代一次。
5．大肠杆菌
（1）短期保存
① 将细菌接种到脑心浸液琼脂斜面，于35℃培养24h±2h。
② 在4℃冷藏斜面培养物。
③ 每月进行传代。
（2）长期保存
① 将细菌接种到脑心浸液琼脂斜面，于35℃培养24±2h。
② 将上述培养物接种到l0mL脑心浸液中。
③ 进行培养，培养温度为35℃，时间为24±2h。
④ 离心培养液，然后用l0mL巴氏磷酸盐缓冲液冲洗细胞两遍。
⑤ 用10mL巴氏磷酸盐缓冲液重悬细胞。
⑥ 在一份冲洗过的细胞悬浮液里加入一份双料脱脂牛奶。脱脂牛奶是用200g脱脂奶粉加入lL蒸馏水，然后在121℃下高压15min制得。
⑦ 将上步所获得的混合物分装成l mL~2mL，进行冻干处理。
⑧ 可在室温(2l℃~23℃)条件下保存4~5年。
6．单核细胞增生李斯特氏菌
（1）短期保存
① 接种细菌于10mL含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤或10mL胰蛋白磷酸盐肉汤。
② 于30℃~35℃培养48h±2h。
③ 再接入含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂或营养琼脂斜面上。
④ 于30℃~35℃培养48 h±2h。
⑤ 4℃冷藏斜面培养物。
⑥ 每个月进行传代。
（2）长期保存
① 接种细菌于10mL含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤或10mL胰蛋白磷酸盐肉汤。
② 于30℃~35℃培养48h±2h。
③ 在肉汤培养物内加入甘油使最终浓度达到10％。
④ 分装成2 mL~3mL，在-70℃或更低温度进行冷冻。
⑤ 每6个月传代。
7．沙门氏菌
（1）短期保存
① 将细菌接种在脑心浸液琼脂斜面，于35℃培养24 h±2h。
② 将培养物置于室温(21℃~23℃)，避光环境。
③ 每两个星期传代一次。
（2）长期保存
保存沙门氏菌不建议使用冻干法，因为细菌的鞭毛和菌体抗原可能会因此遭到破坏。
① 将菌种接种到血琼脂斜面，于35℃条件下培养24h±2h。
② 用无菌接种环（1µL）在斜面的表面收集培养物。
③ 收集到的培养物接种到装有半固体胰酪胨琼脂培养基(不加酚红)。制做此培养基的方法：溶解20g胰酪胨和3.5g琼脂到1L水中。分装1mL~2mL到l0mm×75mm带金属箔片盖的试管内。将试管于116℃~118℃灭菌15min。冷却后，在无菌条件下用软木塞封好试管口。软木塞应该事先浸泡在煮沸的石蜡里5min。
④ 接种好的试管于35℃培养24h±2h。
⑤ 培养物在室温(2l℃~23℃)避光处保存。
⑥ 每3年进行传代。    
8．志贺氏菌
  与大肠杆菌相同。
9．金黄色葡萄球菌
（1）短期保存
① 接种细菌到装有10mL胰酪胨大豆肉汤的试管，然后于35℃培养24h±2h。
② 将培养物在胰酪胨大豆琼脂斜面上划线，于35℃培养24h±2h。
③ 室温保存(21℃~23℃)。
④ 每周传代。
（2）长期保存
① 接种细菌到装有10mL胰酪胨大豆肉汤的试管，然后于35℃培养24h±2h。
② 加入甘油使最终浓度达到20％，分装成2mL~3mL在-80℃下冷冻。或者，加入足够量灭菌矿物油，将胰酪胨大豆琼脂斜面培养物覆盖。
③ 对于以上两种长期保存方法，都需要每年进行传代。
④ 还有一种方法是将胰酪胨大豆肉汤培养6h~12h培养物，取出2mL加入灭菌的80％甘油2mL放入冻存管，立即在-70℃进行冷冻。每隔6个月进行传代。
10．霍乱弧菌
（1）短期保存
① 将细菌深度穿刺接种到T1N1培养基。T1N1培养基制备方法：将10g胰酪胨、10g氯化钠、20g琼脂溶解到lL蒸馏水中。分装4mL到13mm×100mm带螺旋盖的试管内。121℃，灭菌15min。不需调pH值。
② 拧松试管盖进行接种，于35℃培养24h±2h。
③ 将试管盖拧紧，在4℃下保存。
④ 每周进行传代。
（2）长期保存
① 接种入10mL T1N1肉汤，于35℃培养6h~12h。
② 取2mLT1N1培养物加入2mL灭菌80％甘油，装入冻存管，立即冷冻到-70℃。
③ 每隔6个月进行传代。
11．副溶血性弧菌
（1）短期保存
① 深度穿刺接种保存培养基。保存培养基制备方法： 3g的酵母浸膏、10g蛋白胨、30g氯化钠、3g琼脂，溶解到1L蒸馏水中。分装4mL到13mmx100mm带螺旋帽的试管内。121℃，灭菌15min。不需调pH值。
② 拧松试管盖进行接种，于35℃培养24h±2h。
③ 将试管帽拧紧，室温(21℃~23℃)保存。不能冷藏。
④ 每周进行传代。
（2）长期保存
① 接种细菌到含3％氯化钠(最终浓度)的 10mL胰酪胨大豆肉汤中，于35℃培养6h~12h。
② 在1mL肉汤培养物内加入0.09mL灭菌的二甲亚砜，装入无菌冻存管，立即在-70℃进行冷冻。
③ 每6个月进行传代。
12 创伤弧菌
与副溶血性弧菌相同
13 酵母菌和霉菌
（1）短期保存
    在接种前要对培养物进行检查看是否被其他酵母菌和霉菌污染。看不清楚时，用解剖镜检查。
① 在装有30mL马铃薯葡萄糖琼脂的平板划线，平板中添加有酒石酸或抗生素。选择抗生素比酒石酸好，因为储液较易制备，而且不会引起像pH值较低对某些酵母菌和霉菌抑制的情况。
    酒石酸添加方法：用经过0.45μm膜过滤除菌的10％酒石酸溶液调整琼脂培养基的pH值至3.5±0.1。用滴定的方法决定调至pH3.5所用的溶液量。溶液加入培养基以后允许部分培养基凝固，使用酸度计来检查pH值。
在抗生素的选择中，盐酸四环素是首选抗生素，有效浓度40mg/L。其他抗生素，例如：氯霉素或链霉素也可以使用，浓度和盐酸四环素的一样。抗生素储液的制作过程是溶解1g抗生素到100mL无菌蒸馏水中，然后用0.45μm的膜过滤除菌。将储液存放在4℃~8℃避光处。存储时间不要超过1个月。在使用之前要将储液提前放到室温环境(21℃~23℃)。每配制250mL培养基，加入1mL上述储液，终浓度即为40 mg/L。
② 于22℃~25℃培养琼脂平板，直到菌落直径达到3 cm~5cm(霉菌大约需要一周，酵母大约需要两周)。
③ 挑选单菌落接种到加有酒石酸或抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂斜面。
④ 将试管在22℃~25℃培养一周(霉菌)或两周(酵母菌)。
⑤ 将培养物在4℃进行冷藏。
⑥ 每两个月进行传代。
（2）长期保存
① 接种加有酒石酸或抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂斜面。
② 在22℃~25℃培养一周(霉菌)或二周(酵母)。
③ 用灭菌矿物油或甘油浸没琼脂斜面培养物。
④ 在4℃环境储存。
⑤ 每6个月进行传代。
⑥ 另一种方法是用无菌蒸馏水淹没正在生长的琼脂斜面。涡旋混和使斜面上的孢子或细胞悬浮。
⑦ 取1mL悬浮液放入装有5g土壤的试管。(土壤要经121℃，灭菌1h)
⑧ 在4℃进行储存。
⑨ 一年进行一次传代。
14．小肠结肠炎耶尔森氏菌
培养温度如果超过30℃，或培养的次数太多，有可能使致病的质粒丢失。
（1）短期保存
① 接种细菌到装有10mL牛肉浸出肉汤或脑心浸出肉汤的试管，于26℃培养48h±2h。
② 在胰酪胨大豆琼脂斜面上划线，培养温度26℃，时间为48h±2h。
③ 在室温避光处储存。
④ 每月进行传代。
（2）长期保存
① 接种细菌到装有10mL牛肉浸出肉汤或脑心浸出肉汤的试管，于26℃培养48h±2h。    
② 加入甘油，使最终浓度在10％~20％。
③ 分装2mL~3mL，在-70℃或更低温度冷冻。
④ 每4~6个月进行传代。

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