军团菌检测设备

    军团菌及军团菌病：军团病系1976年在费城美国退伍军人年会中首次发现的急性发热性肺部疾患而被命名的.军团菌是引起军团病的病原菌,广泛存在于自然界及建筑给水系统中,特别是封闭式的公共场所.如地铁、火车站、办公环境、医院、影剧院、宾馆等,城市的大型建筑物中通常配备有中央空调系统、冷热水管道以及加湿器,军团菌常常以气溶胶方式感染人群.军团菌是近20年来新发现的传染病之一。
哪些地方要检测军团菌：集中空调通风系统、循环冷却水、冷凝水、沐浴用水、饮用水等。
 
军团菌检测设备包括哪些仪器设备试剂耗材？
军团菌检测设备包括军团菌检测仪器和设备以及军团菌培养基、军团菌生化鉴定套装、军团菌诊断血清等产品。
军团菌检测设备在WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范附录B中有详细说明。
 
WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范
附 录B（规范性附录）集中空调系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法
11.1 B.1 总则
本附录规定了用培养法定性测定集中空调系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中的嗜肺军团菌，其他洗浴水、温泉水、景观水等样品中的嗜肺军团菌测定可参照执行。
11.2 B.2 术语和定义
下列术语和定义适用于本方法。
B.2.1
嗜肺军团菌  legionella pneumophila
样品经培养在GVPC琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长，进一步经生化实验和血清学实验鉴定确认的菌落。
11.3 B.3 仪器和设备
B．3.1 平皿：Φ90 mm。
B．3.2  CO₂培养箱：35℃～37℃。
B．3.3 紫外灯：波长360 nm±2 nm。
B．3.4 滤膜过滤器。
B．3.5 无菌滤膜：孔径0. 22 μm~0. 45 μm。
B．3.6 真空泵。
B．3.7 离心机。
B．3.8 涡旋振荡器。
B．3.9 普通光学显微镜、荧光显微镜。
B．3. 10 水浴箱。
B．3. 11  广口采样瓶：玻璃或聚乙烯材料，磨口，容积500 mL。
 
11.4 B.4 培养基和试剂
B．4,1  GVPC琼脂平板。
B．4.2  BCYE琼脂平板。
B．4.3 BCYE-CYE琼脂平板。
B．4.4 革兰氏染色液。
B．4.5 马尿酸盐生化反应管(军团菌生化鉴定套装）。
B．4.6 军团菌分型血清试剂。 11.5 B．5 采样
B．5.1 将广口采样瓶（B．3.11）用前灭菌。
B．5.2  每瓶中加入Na2S203溶液（c=0.1 mol/L）O.3 ml_～0.5 mL，中和样品中的氧化物。
B．5.3 水样采集位置：冷却水采样点设置在距塔壁20 cm、液面下10 cm处，冷凝水采样点设置在排水管或冷凝水盘处。
B．5.4 每个采样点依无菌操作取水样约500 mL。
B．5.5 采集的样品2d内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15 d。
11.6 B.6 检验步骤
B．6.1  样品的沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000 r/min离心1 min去除。
B．6.2 样品的过滤：将经沉淀或离心的样品通过滤膜（B．3.5）过滤，取下滤膜置于15 mL灭菌水中，充分洗脱，备用。
 
B．6.3 样品的热处理：取1 mL洗脱样品，置50℃水浴（B．3.10）加热30 min。
B．6.4 样品的酸处理：取5 mL洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5 mm。
B．6.5 样品的接种：取洗脱样品（B．6.2）、热处理样品（B．6.3）及酸处理样品（B．6.4）各0. 1 mL，分别接种GVPC平板（B．4.1）。
B．6.6  样品的培养：将接种平板静置于CO2培荞箱（B．3.2）中，温度为35℃-37℃，CO：浓度为2. 5%。无CO2培养箱可采用烛缸培养法。观察到有培养物生成时，反转平板，孵育10 d，注意保湿。
B．6.7 菌落观察：军团菌生长缓慢，易被其他菌掩盖，从孵育第3天开始每天在显微镜（B．3．9）上观察。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。
 
B．6.8 菌落验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE琼脂平板（B．4.2）和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板（B．4.3），35℃～37℃培养2 d，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L一半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。
B．6.9 菌型确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。
生化培养：氧化酶（-／弱+），硝酸盐还原（-），尿素酶（-），明胶液化（+）．水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
 
附录G（规范性附录）集中空调送风中嗜肺军团菌检验方法
16.1 G.1 总则
本附录规定了用液体冲击法测定集中空调系统送风中的嗜肺军团菌。
16.2 G.2 术语和定义
下列术语和定义适用于本方法。
G.2.1
嗜肺军团菌  legionella pneumophila
样品经培养在GVPG琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长，进一步经生化实验和血清学实验鉴定确认的菌落。
16.3 G.3 仪器和设备
G.3.1  微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100 L/min.，对于直径3.0μm以上粒子其捕集效率≥80%或浓缩比≥8。
G.3.2 液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7 L/min-15 L/min.，对于0.5μm粒子的捕集效率≥90%。
G.3.3 离心管：容积50 mL。
G.3.4 平皿：Φ90 mm。
G.3.5  CO2培养箱：35℃～37℃。
G.3.6  紫外灯：波长360 nm±2 nm。
G.3.7  涡旋振荡器。
G.3.8 普通光学显微镜、荧光显微镜。
G.3.9 水浴箱。
16.4 G.4 试剂和培养基
G.4.1  采样吸收液1-GVPC液体培养基
G.4.1.1 GVPC添加剂成分：
多粘菌素B硫酸盐    10 mg
万古霉素    0.5 mg
放线菌酮    80 mg
G.4.1.2   BCYE添加剂成分：
α一酮戊二酸    1．0 g
N-2酰胺基一2胺基乙烷磺酸（ACES）  10.0 g
氢氧化钾    2. 88 g
L-半胱氨酸盐酸盐   0.4 g
焦磷酸铁    0. 25 g
 
G.4.1.3  吸收液成分：
活性碳    2g
酵母浸出粉    10 g
GVPC添加剂    见G.4.1.1
BCYE添加剂    见G.4.1.2
蒸馏水    1000 mL
 
G.4.1.4制法：将活性碳、酵母浸出粉加水至1 000 mL，121℃下高压灭菌15 min，加入GVPC添加剂（G．4.1.1）和BCYE添加剂（G.4.1.2），分装于灭菌后的离心管（G.3.3）中备用。
 
G.4.2  采样吸收液2-酵母提取液
G.4.2.1  吸收液成分：
酵母浸出粉    12 g
蒸馏水    1 000 mL
 
G.4.2.2制法：将酵母浸出粉加水至1 000 mL，121℃下高压灭菌15 min，分装于灭菌后的离心管（G.3.3）中备用。
G.4.3  盐酸氯化钾溶液[c（HCI·KCI） =0. 01 mol/L]
G.4.3.1成分：
盐酸（0.2 mol／L）    3.9 ml_,
氯化钾（0.2 mol/L）    20 mL
G.4.3.2制法：将上述成分混合，用1mol/L）氢氧化钠调整pH=2.2±0.2，121℃下高压灭菌15 min备用。
G.4.4  其他试剂
G.4.4.1 GVPC琼脂平板。
G.4.4.2   BCYE琼脂平板。
G.4.4.3   BCYE-CYE琼脂平板。
G.4.4.4 革兰氏染色液。
G.4.4.5 马尿酸盐生化反应管。
G.4.4.6 军团菌分型血清试剂。
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